preparat-pri-perelomah

В нашей стране зарегистрировано  несколько тысяч биологически активных добавок к пище отечественного и импортного производства. Приобретая их, потребить должен быть уверен не только в их эффективности, но и безопасности. Проверка последней осуществляется на животных, по её результатам препарату присваивается класс опасности. Препарат при переломах Остеомед Форте достойно выдержал все испытания, его безопасность доказана. Но обо всём – по порядку.

Остеомед Форте – натуральное средство в помощь костям

В жизни каждого человека однажды наступает период, когда деятельность половых желёз  начинает постепенно угасать. Половых гормонов, регулирующих многие жизненно важные функции организма, продуцируется всё меньше и меньше. Человек начинает замечать нарушения в работе различных органов и систем. Его мучает вялость, сонливость, быстрая утомляемость, снижение интеллектуальных способностей. Меняется осанка, рост, развивается остеопороз. Любой поход в магазин зимой может закончиться переломом, так как состояние костей, их плотность и прочность напрямую зависит от гормонального фона.

Существующие препараты, используемые в терапии остеопороза, к сожалению, далеко не безопасны. Результатом их приёма может стать гиперкальцификация мягких тканей, остеонекроз челюсти – обнажение и разрушение челюстных костей и даже рак органов репродуктивной системы.

Препарат при переломах «Остеомед Форте» – новейшая разработка отечественных учёных для восстановления и формирования структуры костной ткани, повышения её плотности, скорейшего сращивания переломов. Его основным компонентом является натуральное вещество, способствующее естественной нормализации гормонального фона.

Препарат не оказывает токсического влияния на организм человека и абсолютно безопасен даже при приёме в больших дозах. Это доказали специалисты Государственного научного центра прикладной микробиологии и биотехнологии во главе с доктором биологических наук И. Г. Шемякиным.

Как новый препарат при переломах исследовался на токсичность

Для оценки токсичности Остеомеда Форте препарат при переломах вводили лабораторным животным. Для участия в исследовании были отобраны 50 беспородных мышей и 50 крыс Wistar.

Грызуны были поделены на несколько экспериментальных (опытных) и контрольных групп. Животным опытных групп разными способами (внутрижелудочно и внутрибрюшинно) вводили раствор Остеомеда Форте. Дозировки препарата в разных экспериментальных группах варьировали от 500 до 5000 мг/кг массы тела.  Подопытным контрольных групп вводили дистиллированную воду в тех же объёмах.

Первые сутки после введения препарата за мышами и крысами осуществлялось непрерывное наблюдение. Со вторых суток грызунов ежедневно осматривали в первой половине дня. Обращалось особое внимание на их общее состояние, особенности поведения, интенсивность и характер двигательной активности, наличие и характер судорог, координацию движений, тонус скелетных мышц, состояние шерстяного и кожного покровов и некоторые другие показатели работы организма животных. Также ежедневно отслеживались малейшие изменения в весе подопытных, количество потребляемых ими воды и корма.

По окончании исследования животные были подвергнуты эвтаназии и некропсии (вскрытию) для изучения состояния органов брюшной и грудной полости.

Вывод исследователей: препарат при переломах Остеомед Форте безопасен

Исследователи зафиксировали тот факт, что животные, получавшие препарат при переломах Остеомед Форте, не отставали в весе от грызунов контрольной группы. Не было различий и в количестве потребляемых пищи и воды. Цвет, консистенция, эластичность внутренних органов крыс и мышей экспериментальных групп соответствовали норме.

На основании полученных результатов был сделан вывод: препарат Остеомед Форте относится к IV классу опасности – малоопасные. А это значит, что его приём в рекомендуемых дозировках не нанесёт вреда организму человека.

 

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Федеральное бюджетное учреждение науки

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ПРИКЛАДНОЙ МИКРОБИОЛОГИИ И БИОТЕХНОЛОГИИ (ФБУН ГНЦ ПМБ)

 

УТВЕРЖДАЮ
Директор ФБУН ГНЦ ПМБ

академик РАН, д. м. н., профессор

__________________ И.А. Дятлов
«____»_________________ 2019 г.

 

ОТЧЕТ

ОБ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИХ ИСПЫТАНИЯХ

«Исследования острого токсического действия нового лекарственного вещества ОСТЕОМЕД – Форте in vivo»

(по договору № 708-н/2018 от 12.11. 2018 г

Оболенск 2019

СПИСОК ИСПОЛНИТЕЛЕЙ

 

Зам. директора

доктор биол. наук

 

______________________

 

И.Г. Шемякин

 

Старший научный сотрудник

канд. биол. наук

 

 

 

____________________

 

 

 

Т.И. Комбарова

 

 

 

Научный сотрудник

 

 

 

 

 

 

_____________________

 

 

 

Т.И. Рудницкая

Старший научный сотрудник,

канд. мед. наук

 

_______________________

 

О.Ю. Манзенюк

 

 

 

Младший научный сотрудник

 

 

 

___________­­­___________

 

 

 

Я.О. Мунтян

 

Реферат

Отчет: 27 с., 4 табл., 2 рис.

Мыши беспородные, крысы линейные Вистар (Wistar), острое токсическое действие, активные компоненты препарата «ОСТЕОМЕД Форте», ЛД50 — средняя летальная доза.

В отчете представлены результаты исследований, проведенных по договору № 708-н/2018 от 12 ноября 2018 г. между ООО «ПАРАФАРМ» и ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» (ГНЦ ПМБ).

Объектом исследования являются: комплексный препарат «ОСТЕОМЕД Форте» для профилактики и комплексной терапии остеопороза, остеопении и сопутствующих им заболеваний (артрита, артроза, остеохондроза и других патологий опорно-двигательной системы, а также пародонтита); в реабилитационный период при переломах для профилактики остеопороза и других травм костей и суставов.

Цель исследования: экспериментальное изучение острого токсического действия и определение класса опасности нового препарата ОСТЕОМЕД ФОРТЕ при однократном пероральном и парентеральном введении крысам Вистар и беспородным мышам и наблюдение за животными в течение 14 дн

 

Область применения  — медицина

 

Реферат

ОБОЗНАЧЕНИЯ, СОКРАЩЕНИЯ……………………………………………….………..5

Регулирующие стандарты………………………………………………………………….6

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

  1. Материалы и методы……………………………………………………………….7
  2. Программа исследований………………………………………………………….11
  3. Результаты исследований………………………………………………………….16

ЗАКЛЮЧЕНИЕ……………………………………………………………………………..16

Приложение 1……………………………………………………………………………    17

Приложение 2. Ветеринарный протокол……………………………………………….   19

 

ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ

 

per os ……………………

в/бр………………………

ЛД50  …………………..

 

.

 

 

 

 

 

 

пероральное (внутрижелудочное) введение

внутрибрюшинное введение

средняя летальная доза

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Регулирующие стандарты

Все работы проводились в соответствии со следующей нормативно- технической документацией:

  1. СП 2.2.1.3218-14 «Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)» от 29.08.2014г;
  2. Правила лабораторной практики в Российской Федерации (Приказ Министерства Здравоохранения Российской Федерации №267 от19.06.2003);
  3. ГОСТ12.1.007-76ССБТ. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности (с Изменениями№1,2);
  4. Хабриев Р.У. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Москва, 2005 с.40-46;
  5. Миронов А.Н. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Гриф и К, 2012;
  6. «Методические рекомендации по изучению общетоксического действия лекарственных средств». Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. М. Гриф и К, 2012, с. 13-24.

 

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

  1. Материалы и методы

Реактивы и приборы

Холодильник бытовой, обеспечивающий температуру 4 °С («Stinol», Россия);

Шкаф вытяжной Ш2НЖ (Россия);

Ламинарный шкаф «Лабораторные системы» для работы с микроорганизмами 3-4 групп патогенности (Россия);

Пробирки лабораторные полипропиленовые с закручивающимися пробками вместимостью 15 мл и 50 мл, стерильные («Corning Costar», США);

Пробирки микроцентрифужные вместимостью 0,5 мл, 1,5 мл, 2,0 мл («Eppendorf», Германия);

Наконечники для регулируемых автоматических пипеток («Eppendorf» Германия);

Пипетки регулируемые автоматические вместимостью 0,5-10, 10-100, 100-1000 мкл («Eppendorf», Германия);

Пипетки стерильные пластиковые градуированные вместимостью 0,1-1,0; 2,0 мл («Corning Costar», США);

Пробирки микробиологические стеклянные по ГОСТ 1770-74;

Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ Р 51652-2000;

Перекись водорода 30 % по ГОСТ 177-88;

 Животные

Вид: крысы линейные Вистар, мыши беспородные

Пол: самцы и самки

Количество животных: крысы линейные Вистар (Wistar) – 30 голов (15 самцов и 15 самок); мыши беспородные 40 голов (20 самцов и 20 самок).

Масса тела: 175-190г, 20-23г соответственно.

Поставщик: Филиал «Андреевка» ФГБУН НЦБМТ МБА России.

 Условия содержания и кормление

Размещение животных и условия содержания будут соответствовать виду(мыши, крысы) в поликарбонатных микроизоляторах «LabProducts Inc.» (США) и обеспечивать стандартность проведения исследований, согласно СП2.2.1.3218-14 «Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)» от 29.08.2014г.

Животных содержали в контролируемых условиях окружающей среды (при температуре от 18 до 26 °C и относительной влажности воздуха от 30 до 70 %). Освещение с чередованием 12 часов света и 12 часов темноты. Воздухообмен в помещениях для содержания животных должен составлять 12-15 об/ч.

В исследовании в качестве стандартного рациона используют гранулированные полнорационные корма ПК-120 для содержания мышей и крыс, изготовленный по ТУ 9296-002-70941247-2005 (ООО «Лабораторкорм»). Корм и воду давали ad libitum.

 Обеспечение соблюдения принципов гуманного обращения с подопытными животными

Все предполагаемые в данном исследовании манипуляции с животными, а также условия их кормления и содержания одобрены биоэтической комиссией.

Схема эксперимента при определении острой токсичности, обоснование выбора тест-системы, условий применения и введения тестируемого вещества.

В качестве лабораторных моделей использовали опытные и контрольные группы животных (крысы линейные Вистар и беспородные мыши), широко используемые в исследованиях безопасности новых лекарственных средств.

Лекарственное средство «ОСТЕОМЕД Форте» оказывает многоуровневое действие: способствует регуляции фосфорно-кальциевого обмена, эффективному и безопасному восстановлению и формированию структуры костной ткани; подавляет костную резорбцию и стимулирует остеогенез; увеличивает минеральную плотность костной ткани. Являясь источником природных прогормонов, препарат способствует безопасной нормализации гормонального фона и формированию коллагена.

Исследуемый препарат предназначен для перорального применения взрослым по 2 таблетки массой 500мг 2 раза в день во время еды. Продолжительность приема – 1 месяц.

У мелких лабораторных животных токсичность фармакологического вещества исследуют при нескольких путях введения, перорально – путь, при котором была показана специфическая активность средства «ОСТЕОМЕД Форте». Парентеральный путь введения может дать ориентировочные данные о скорости и степени всасывания средства.

Общие условия распределения животных по группам и дозирования препарата «ОСТЕОМЕД Форте» приведены в таблице 1.

Табл. 1. Расчет доз для перорального и парентерального (внутрибрюшинного) введения препарата «Остеомед форте».

 

Доза (мг/кг)Путь введенияКоличество животных

(5-самок и 5- самцов)

Кол-во введенийМасса тела 1животногоКол-во вещества (мг)Объем дозы (мл/сут)
Мыши5000per os1010.02213200.5
2000per os1010.0225280.5
2000в/бр*1010.0225280.5
Крысы5000per os1010.2120003.0
2000per os1010.248003.0
per os – перорально; *внутрибрюшинно — парентерально

 

Полученные результаты должны обеспечить возможность вычисления ЛД50 – средней летальной дозы, которая вызывает гибель 50% подопытных животных при однократном введении в желудок, с последующим 14- дневным сроком наблюдения. Если препарат обладает низкой токсичностью, тогда следует указать максимальную дозу, которая вводилась животным, но не менее 2 г/кг.

Распределение по группам и идентификация животных

Животные были распределены по группам рандомизированно, с использованием в качестве основного критерия величину массы тела таким образом чтобы различия в массе тела между особями одного пола не превышали 20%.

Идентификация животных была произведена методом этикирования клеток.

Методы исследования

Прижизненные манипуляции с животными.

В первый день после введения препарата животные находились под непрерывным наблюдением, а далее осуществляли ежедневный осмотр животных в первой половине дня в течение 14 суток. Массу тела животных определяли ежедневно в течение 7 суток и по окончанию срока наблюдения на 14 сутки. Определяли поедаемость корма и воды в течение 3-х первых суток с начала исследования.

Патоморфологическая картина

Массу тела, определенную после ночи голодания перед некропсией, использовали для определения массовых коэффициентов органов (масса органа в граммах в расчете на 1кг массы тела).

Предмет исследований

Предметом исследований является:

«ОСТЕОМЕД Форте» —  комплексный препарат для профилактики и комплексной терапии остеопороза, остеопении и сопутствующих им заболеваний (артрита, артроза, остеохондроза и других патологий опорно-двигательной системы, а также пародонтита); в реабилитационный период при переломах, для профилактики остеопороза и других травм костей и суставов.

Исследуемые препараты

В ходе исследования использовали двукратные серийные разведения исследуемого препарата «ОСТЕОМЕД ФОРТЕ» (таблетка и отдельные активные компоненты без наполнителя — премикс).

Табл. 2. Рецептура препарата «ОСТЕОМЕД ФОРТЕ» по ТУ 9197-060-41395157-12 с изм. № 1

Наименование ингредиентовКоличество ингредиентов,

мг/табл

 

Количество ингредиентов,

%

Цитрат кальция (активный компонент)250,050,0
Лактоза (вспомогательный компонент, наполнитель)188,037,6
Гомогенат трутневый (активный компонент)50,010,0
Кальций стеариновокислый (вспомогательный компонент, скользящее вещество)10,02,0
Витамин D3 (субстанция с активностью 100000 МЕ/г) (активный компонент)1,50,3
Пиридоксина гидрохлорид (активный компонент)0,50,1
Итого:500,0100,0

 

 Описание и характеристики исследуемого препарата.

«ОСТЕОМЕД  Форте» — таблетка круглой формы, с гладкой поверхностью, белого с желтоватыми вкраплениями цвета.

Состав: каждая таблетка содержит:

Витамин В6 (пиридоксина гидрохлорид)(0,5мг)

Витамин D3 (холекальциферол)(3,75мкг)

Цитрат кальция(250мг)

Органический анаболический компонент природного происхождения (гомогенат трутневый с витамином В6), адсорбированный на глюкозе(50мг).

Вспомогательные вещества: лактоза(188,0), кальций стеариновокислый(10,0мг)(добавка, препятствующая слеживанию и комкованию).

  1. Программа исследований

План исследования и его дизайн разработаны в соответствии с «Методическими рекомендациями по изучению общетоксического действия лекарственных средств». Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая.- М. Гриф и К, 2012.-с. 13-24.

В доклиническом исследовании по изучению острой токсичности препарата «ОСТЕОМЕД ФОРТЕ» целью является определение переносимых и летальных доз вещества и причин наступления гибели животных с анализом клинической картины интоксикации при однократном введении исследуемого вещества.

В экспериментальном исследовании в качестве тест-систем взяты крысы Вистар и беспородные мыши, широко используемые при испытаниях  безопасности новых лекарственных средств.

С учетом назначения, условий применения в программу исследований препарата  «ОСТЕОМЕД ФОРТЕ», производитель ООО «ПАРАФАРМ» входило: оценка острой токсичности при разных путях поступления в организм (перорально и парентерально).

2.1. Ключевые даты исследования

Дата начала исследования: 17.05.2019 г.

Дата окончания исследования: 30.05.2019 г.

2.2 Ответственные за выполнение этапов исследования:

Формирование групп животных, введение препарата, клинические наблюдения:  Комбарова Т.И., Рудницкая Т.И.

2.2. Обеспечение условий содержания и кормления животных, ветеринарный контроль: Комбарова Т.И., Рудницкая Т.И., Мунтян Я.О.

План исследования и его дизайн разработаны в соответствии с «Методическими рекомендациями по изучению общетоксического действия лекарственных средств». Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая.- М. Гриф и К, 2012.-с. 13-24.

 2.3. Схема эксперимента по определению острой токсичности, обоснование выбора тест-системы, условий применения и введения тестируемого вещества.

В качестве лабораторных моделей использовали опытные и контрольные группы животных (крысы Вистар и беспородные мыши), широко используемые в исследованиях безопасности новых лекарственных средств.

Лекарственное средство «ОСТЕОМЕД Форте» оказывает многоуровневое действие: способствует регуляции фосфорно-кальциевого обмена, эффективному и безопасному восстановлению и формированию структуры костной ткани; подавляет костную резорбцию и стимулирует остеогенез; увеличивает минеральную плотность костной ткани. Являясь источником природных прогормонов, препарат способствует безопасной нормализации гормонального фона и формированию коллагена.

Исследуемый препарат предназначен для перорального применения взрослым по 2 таблетки массой 500мг 2 раза в день во время еды. Продолжительность приема – 1 месяц.

У мелких лабораторных животных токсичность фармакологического вещества исследуют при нескольких путях введения, перорально – путь, при котором была показана специфическая активность средства ОСТЕОМЕД Форте и парентеральном пути введения, который может дать ориентировочные данные о скорости и степени всасывания средства.

Общие условия распределения животных по группам и дозирования препарата Остеомед форте приведены в таблице 1.

Табл. 1. Расчет доз для перорального и парентерального (внутрибрюшинного) введения препарата «Остеомед форте».

 

Доза (мг/кг)Путь введенияКоличество животных

(5-самок и 5- самцов)

Кол-во введенийМасса тела 1животногоКол-во вещества (мг)Объем дозы (мл/сут)
Мыши5000per os1010.02213200.5
2000per os1010.0225280.5
2000в/бр*1010.0225280.5
Крысы5000per os1010.2120003.0
2000per os1010.248003.0
per os – перорально; *внутрибрюшинно — парентерально

 

Полученные результаты должны обеспечить возможность вычисления ЛД50 – средней летальной дозы, которая вызывает гибель 50% подопытных животных при однократном введении в желудок, с последующим 14- дневном сроком наблюдения. Если препарат обладает низкой токсичностью, тогда следует указать максимальную дозу, которая вводилась животным, но не менее 2 г/кг.

  1. Результаты

 Оценка острой токсичности препарата  «ОСТЕОМЕД Форте».

Изучение острой токсичности препарата «ОСТЕОМЕД Форте» проводили на крысах линии Вистар и на белых беспородных мышах (самках и самцах, массой тела 180 – 195 и 20 – 22 грамма соответственно).  Исследуемый препарат вводили внутрижелудочно крысам в объеме 3 мл и мышам в объеме 0.5 мл, контрольным животным вводили дистиллированную воду в том же объёме. Мышам дополнительной группы вводили исследуемый препарат внутрибрюшинно в объеме 0.5 мл (оценивали степень проникновения в паренхиматозные органы).

На протяжении всего периода (24 часа) наблюдения гибели животных не было зарегистрировано, не отмечалось изменений внешнего вида, поведения, двигательной активности по сравнению с контрольной группой животных.

Изучение острой токсичности препарата «ОСТЕОМЕД Форте» проводили на крысах Вистар и на белых беспородных мышах (самках и самцах, массой тела 180 – 195 и 20 – 22 грамма соответственно).  Исследуемый препарат вводили внутрижелудочно крысам в объеме 3 мл и мышам в объеме 0.5 мл, контрольным животным вводили дистиллированную воду в том же объёме. Мышам дополнительной группы вводили исследуемый препарат внутрибрюшинно в объеме 0.5 мл (оценивали степень проникновения в паренхиматозные органы).

На протяжении всего периода (24 часа) наблюдения гибели животных не было зарегитрировано, не отмечалось изменений внешнего вида, поведения, двигательной активности по сравнению с контрольной группой животных.

В период наблюдения проводили учет веса тела животных. Данные учета веса тела животных представлены в таблице 2.

Табл.  2 . Динамика изменения веса тела крыс и мышей при оценке острой токсичности препарата «Остеомед форте».

Вес самок крыс Вистар
123456714
5000мг/кг в/ж188.3188.5188.6190190190.3190.7192.5
2000мг/кг в/ж182.8183,3189,2192,7198,8200,7201,1203,8
контроль178.9180.1180.3181181.2181.5182.1184.2
Вес самцов крыс Вистар
123456714
5000мг/кг в/ж193.6193.9194195.3196.8198.1198.8204.3
2000мг/кг в/ж186,9188,8193,5201,7206.1210,9215,9219,9
 контроль189.5190.1192.7193.1193.7194.5196.7200.7

 

Вес самок мышей
123456714
5000мг/кг в/ж22,022,723,924,224,825,325,525,7
2000мг/кг в/ж22,023,324,625,426,427,127,227,4
5000 мг/кг в/бр22,122,824,124,825,826,526,627,6
контроль23,625,226,627,327,828,428,628,8
Вес самцов мышей
123456714
5000мг/кг в/ж22,223,925,827,528,029,429,730,6
2000мг/кг в/ж22,323,925,526,427,128,129,029,8
5000 мг/кг в/бр22,222,223,925,727,229,230,731,3
контроль21,722,122,624,124,826,728,529,7

 

Вес экспериментальных животных независимо от дозы препарата и пути введения был сопоставим с группой контроля, что указывает на безвредность испытуемого препарата «Остеомед форте».

Для характеристики токсического действия препарата «Остеомед форте» учитывали потребление корма и воды. Данные учета потребления корма представлены в таблице 3.

Табл. 3. Потребление корма и воды животными после однократного внутрижелудочного введения биологически активной добавки «Остеомед форте» в первых 3-х суток наблюдения.

 

Вид животныхПолДоза мг/кгКоличество корма съеденного за сутки, г/животноеКоличество выпитой воды за сутки, мл/животное
1 сутки2 сутки3 сутки1 сутки2 сутки3 сутки
крысысамки500016,716,016,420,522,223,2
самцы500018,119,118,724,523,124,1
самки200016,617,417,923,622,824,8
самцы200017,217,618,524,723,925,9
самки016,316,916,822,823,624,6
самцы017,318,518,924,625,425,4
мышисамки50003,34,14,55,45,25,0
самцы50004,95,25,26,06,77,2
самки20004,54,64,75,65,46,6
самцы20005,05,55,36,06,27,0
самки05,25,35,05,45,65,5
самцы05,65,45,36,36,16,2

Полученные данные свидетельствуют о том, что количество съеденного корма и употребление воды соответствует нормам суточного употребления корма и воды в контрольной группе.

По окончании эксперимента провели эвтаназию животных СО2 – ингаляцией с визуальным макроскопическим исследованием внутренних органов животных и определением относительной массы органов.

На вскрытии животных макроскопических патологических изменений внутренних органов и тканей подопытных животных не выявлено. Органы расположены в брюшной и грудной полости свободно, признаков воспаления брюшины и кишечника не отмечено.

Рис. 1. Брюшная и грудная полость крысы Вистар при дозе введения 5000мг/кг препарата  «Остеомед форте».

Рис. 2. Брюшная и грудная полость мыши при дозе введения 5000мг/кг препарата добавки «Остеомед форте»

При патологоанатомическом осмотре состояние органов брюшной и грудной полости  было без отклонений от нормы (селезенка темно-красного цвета, эластичная, с блестящей прозрачной капсулой; печень красно-коричневого цвета, поверхность блестящая, консистенция плотная;  почки темные, красно-коричневого цвета,

консистенция плотно-эластичная; легкие светло-розовые, воздушные, эластичные, висцеральная плевра — гладкая и блестящая).

Для оценки состояния внутренних органов использовали массовый коэффициент (МК) – процентное отношение массы органа к массе тела.

Расчет массовых коэффициентов производили по формуле:

МК = Масса органа (г)/ масса тела) × 100%, этот показатель при токсикологических исследованиях дает возможность обнаружения органа — мишени.

Таблица 4. Относительная масса органов крыс и мышей опытных и контрольных групп, в %      (М±m), n=5.

КонтрольОпыт, 5000мг/кг
Вид, полпоказателиМасса органов, гМассовый коэффициент %Масса

органов, г

Массовый коэффициент %
Крысы

самки

Масса тела, г183,3190,7
Печень, мг9,8±0,35,3±0,210,6±0,45,5±0,3
Селезенка, мг1,18±0,10,64±0,041,2±0,080,63±0,06
Почки, мг1,43±0,10,78±0,051,48±0,180,78±0,03
Крысы

самцы

Масса тела, г201,8198,7
Печень, мг11,2±0,25,5±0,311,1±0,355,6±0,3
Селезенка, мг1,32±0,080,65±0,061,29±0,030,65±0,03
Почки, мг1,79±0,090,89±0,021,68±0,090,84±0,05
Мыши

самки

Масса тела, г24,227,0
Печень, мг1,62±0,086,7±0,141,63±0,0556,0±0,08
Селезенка, мг0,16±0,020,67±0,040,18±0,010,70±0,03
Почки, мг0,34±0,021,4±0,060,39±0,041,4±0,02
Мыши

самцы

Масса тела, г28,327,7
Печень, мг1,63±0,115,8±0,091,79±0,076,5±0,06
Селезенка, мг0,20±0,060,70±0,020,19±0,030,70±0,03
Почки, мг0,44±0,041,6±0,060,39±0,051,4±0,01

Таким образом, из приведенных в таблице 4 данных данных следует, что  относительная масса органов крыс и мышей не имеют достоверных отличий от аналогичных показателей контрольных животных.

 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Препарат «ОСТЕОМЕД Форте» изготовителя ООО «Парафарм» по показателю «среднелетальная доза (ЛД 50 больше 5000)» относится к IV классу опасности – малоопасные.

 

Литература.

  1. СП 2.2.1.3218-14 «Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)» от 29.08.2014г.
  2. Правила лабораторной практики в Российской Федерации (Приказ Министерства Здравоохранения Российской Федерации №267 от19.06.2003);
  3. ГОСТ12.1.007-76ССБТ. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности (с Изменениями№1,2).
  4. Хабриев Р.У. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Москва, 2005 с.40-46
  5. Миронов А.Н. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств . Гриф и К, 2012.
  6. ГОСТ ISO 10993-11-2011. Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть11. Исследования общетоксического действия.
  7. МУ 2163 – 80 Методические указания к постановке исследований для обоснования санитарных стандартов.
  8. Лист данных по безопасности. Цинкосодержащая антибактериальная композиция. Раздел 11: Токсикологическая информация. 18.09.18г.

 

Приложение1

ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО НАДЗОРУ В СФЕРЕ ЗАЩИТЫ ПРАВ ПОТРЕБИТЕЛЕЙ И БЛАГОПОЛУЧИЯ ЧЕЛОВЕКА

 

Федеральное бюджетное учреждение науки

«Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии»

 

Московская область, Серпуховский округ, Оболенск,

 

Результаты токсикологических исследований in vivo

 

  1. Наименование предприятия, организации : ООО «ПАРАФАРМ»
  2. Юридический адрес: 440026, г. Пенза, ул. Свердлова, д. 4
  3. Изготовитель (фирма, предприятие, организация): ООО «ПАРАФАРМ», 440026, г. Пенза, ул. Калинина 116 А

Страна: Россия.

  1. Место отбора: ООО «ПАРАФАРМ», 440026, г. Пенза, ул. Калинина 116А
  2. Время и даты отбора: 13.05. 2019

 

п/п

Наименование продукции,

№ партии/серии

Дата

изготовления/срок годности

 

Результат наружного

осмотра партии (состояние упаковки, маркировки)

Количество отобранных образцов
для

испытаний и иденти-фикации, г

для

контрольного

хранения, г

Итого,

г

1234567
1ОСТЕОМЕД ФОРТЕ, таблетки 500 мг,

Арт. ОФ_1623

 

10.04.2019

 

Упаковка 120 табл.,

5 упаковок

 

120 Х5 Х0,5

 

0

 

 

 

300

 

  1. Средства измерений:
№ п/пТип прибораЗаводской номер№ свидетельства о проверкеСрок действия
1.Весы электронные Scout PRO SPU20017125081051Сп №АА7104457 от 18.09. 201817.09.2019
2Весы электронные  Explorer(E) E106401122241676Сп №АА7104452 от 18.09. 201817.09.2019

 

  1. Дополнительные сведения:

Образец представлен в приспособленной маркировке из полимерного материала с маркировкой на поверхности тары. Внешний вид: таблетки

РЕЗУЛЬТАТЫ ИСПЫТАНИЙ (ИССЛЕДОВАНИЙ)

 

№№

п/п

Определяемые

показатели

Единицы

измерения

Результаты

испытаний

Величина

допустимого уровня

НД на методы

исследований

123456
 

Образец поступил

дата начала испытаний  17.05.2019 г   дата окончания исследований 31.05.2019г

1Острая пероральная токсичность (LD 50 per os),

Беспородные мыши

мг/кг веса

животного

5000не нормируетсяМУ 2163-80
2Острая пероральная токсичность (LD 50 per os),

Крысы линии Вистар

мг/кг веса

животного

5000не нормируетсяМУ 2163-80

 

Приложение 2

ВЕТЕРИНАРНЫЙ ПРОТОКОЛ Номер протокола:___05/27-2019___
Договор №708-н/2018 от12.11.2018

ООО «ПАРАФАРМ»

Поступил в комитет по биоэтике ___29/05/2019___
Головная организация по проекту:Утвержден (отправлен на доработку) ____-________
ФБУН ГНЦ ПМБПоступил (повторно) ___________
 Дата утверждения _31/05/-2019 __
 Предыдущий номер ____________
 Действует/завершен/прерван____________

 

НАЗВАНИЕ ПРОТОКОЛА: «Исследование острого токсического действия нового лекарственного препарата ОСТЕОМЕД-Форте in vivo»

ВЕДУЩИЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬ:

Зам директора по научной работе ФБУН ГНЦ ПМБ,

д.б.н., проф. Шемякин И.Г. (тел 36-00-60)                       __________________________

 

ПОМОЩНИК ВЕДУЩЕГО ИССЛЕДОВАТЕЛЯ:

с.н.с. лаборатории молекулярной биологии,

к.м.н.Манзенюк О.Ю.                                                        _________________________

 

УЧАСТВУЮЩИЙ/КОНСУЛЬТИРУЮЩИЙ ВЕТЕРИНАР:

с.н.с. лаборатории биологических испытаний,

к.б.н. Комбарова Т.И.                                                         __________________________

 

 

ПРЕДСЕДАТЕЛЬ КОМИССИИ ПО БИОЭТИКЕФБУН ГНЦ ПМБ:

г.н.с.отдела молекулярной микробиологии,

д.в.н., проф. Светоч Э.А.                                                   __________________________

 

 

Название протокола: «Исследование острого токсического действия нового лекарственного препарата ОСТЕОМЕД-Форте in vivo»

Ведущий исследователь:  заместитель директора д.б.н. Шемякин И.Г.;

Помощник ведущего исследователя: старший научный сотрудник  к.м.н. лаборатории молекулярной биологии Манзенюк О.Ю.;

Ассистирующие исследователи: Комбарова Т.И., Рудницкая Т.И., Мунтян Я.О.

 

  1. РЕЗЮМЕ:

Цель – Экспериментальное изучение острого токсического действия нового лекарственного препарата ОСТЕОМЕД-Форте при пероральном и парентеральном применении на лабораторных животных. Определение класса опасности исследуемого нового лекарственного препарата ОСТЕОМЕД-Форте.

 

  1. ПРЕДПОСЫЛКИ К ПРОВЕДЕНИЮ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Современные тенденции доклинических токсикологических исследований фармакологического вещества предполагают установление характера и выраженности его повреждающего действия на организм экспериментальных животных и оценку его безопасности. Первоначально проводят оценку острой токсичности фармакологического вещества, целью которой является определение переносимых, токсических и летальных доз (с использованием статистических методов) и анализ клинической картины интоксикации.

У мелких лабораторных животных токсичность фармакологического вещества исследуют при нескольких путях введения. Фармакологические вещества, предназначенные для системного введения, вводят перорально и парентерально (внутрибрюшинно, если они не растворимы в воде, внутривенно и подкожно, если они растворимы). Сравнение параметров токсичности при разных путях введения может выявить скорость и степень всасывания препарата и позволяет судить о сходстве или различии в механизмах, вызывающих летальный исход при разных путях введения. [1]

С учетом назначения и условий применения в программу исследований биологически активной добавки к пище «ОСТЕОМЕД Форте», (производитель ООО «ПАРАФАРМ») планируется провести:

  1. Оценку острой токсичности при разных путях поступления в организм: в желудок и парентерально в брюшную полость для сравнения токсического действия на организм животных.
  2. Определение массы тела животных.
  3. Определение внешних признаков интоксикации, макроскопической оценки органов.

 

III.      МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

  1. Схема проведения экспериментов и общие процедуры:

1.1 Оценка острой токсичности препарата «Остеомед форте» при внутрижелудочном введении.

Для оценки острой токсичности «Остеомед форте», (производитель ООО «ПАРАФАРМ») и для определения переносимых, токсических и летальных доз с выявлением клинической картины интоксикации будут использоваться два вида животных (беспородные мыши и крысы Вистар) [1].

Для решения поставленных задач и определения LD50 при внутрижелудочном введении будут использовать 4 дозы препарата [ГОСТ12.1.007-76ССБТ] (таблица1).

Раствор препарата «Остеомед форте» опытным животным будут вводить в объеме 0,5 мл мышам и 3 мл крысам с учетом веса животных (20±2 г и 180-190 г соответственно).

На дозу препарата будут использовать по 10 экспериментальных животных (5 самцов и 5 самок в группе).

Таблица 1. Учет гибели животных

Дозы,

мг/кг

Кол-во мышей/

крыс

Сутки наблюденияПало/ всегоС.с.г.,

сутки

 

Ld50
01-14
500010/10
200010/10
100010/10
50010/10
контроль10/10

 

В первый день после введения препарата животные будут находиться под непрерывным наблюдением.

Регулярно в течение 14 суток будет проводиться наблюдение и будут фиксировать общее состояние животных, особенности их поведения, интенсивность и характер двигательной активности, наличие и характер судорог, координацию движений, тонус скелетных мышц, состояние шерстного и кожного покрова, консистенцию фекальных масс, окраску мочи, потребление воды и корма.

Будет учитываться гибель животных.

Все павшие животные будут подвергаться некропсии с оценкой  макроморфологических изменений в органах.

С целью учета реакции организма на токсическое действия препарата будут проводить оценку массы тела животных: ежедневно в течение 7 суток и на 14 сутки.

Выживших животных будут эвтанизировать и проводить некропсию с макроскопическим описанием органов и тканей места введения (степень кровенаполнения органов и наличия кровоизлияний, изъязвлений слизистых оболочек) и будут определять относительную массу органов.

Всего при оценке острой пероральный токсичности будет использовано  50 мышей и 50 крыс.

 

1.2 Оценка токсичности препарата «Остеомед форте» при парентеральном (внутрибрюшинном) введении.

Для данной процедуры будут использовать «Остеомед форте» в максимальной концентрации 5000мг/кг при внутрибрюшинном введении.

В эксперименте будут использованы беспородные мыши, весом 22-24г, самцы и самки по 5 штук.

Будет проводиться наблюдение и оценка физических показателей.

Всего используется: 10 беспородных мышей.

 

  1. Экспериментальные животные и обоснование заказа.

Не применимо

 

2.1. Анализ альтернативных вариантов без использования животных:

Исследование острого токсического действия новых препаратов проводится с использованием лабораторных животных согласно ГОСТ12.1.007-76ССБТ и др. [2-6].

2.2. Лабораторные животные.

а) Род и вид: Мышь (Mus musculus), крыса(Rattus)

б) Линия (порода): мыши, крысы, — беспородные

(поставщик): Филиал «Андреевка» ФГБУН НЦБМТ МБА России

г) Возраст 8-10 недель мыши, крысы.

в) Вес: 20 — 24 г мышь; 180-190г крыса.

е) Пол: самки, самцы.

ж) Особые требования:НЕТ

з) Прочее: НЕТ

2.3. Общее необходимое число животных: мыши –60шт; крысы -50шт.

 

Замена: НЕТ

  1. Технические методы.

3.1. Длительная фиксация: НЕТ

3.2. Хирургические вмешательства: НЕТ

3.3. Наркоз:  НЕТ

3.4. Манипуляции с животными.

3.4.1 Эксперименты с животными проводят в соответствии с СП 2.2.1.3218-14 «Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)» Правила надлежащей лабораторной практики (утв. приказом Министерства здравоохранения РФ от 1 апреля 2016 г. № 199н. Манипуляции с животными будут проводить в специально изолированной комнате для заражений.

3.4.2 Идентификация животных: мыши, крысы будут содержаться группами в клетках соответствующей площади. На клетки вывешиваются этикетки с указанием ответственного исполнителя, номера проекта, номера группы, вида, линии и количества животных, наименования и даты проведения процедуры.

3.4.3 Инъекции:

а) Внутрижелудочное введение. Процедура для оценки острой токсичности будут проводить при помощи тонкого металлического зонда с напаянной на конце оливой. Мышь фиксируется левой рукой за кожную складку шеи и корень хвоста. Для фиксации крысы используются перчатки – краги. Правой рукой зонд вводится в ротовую полость и медленно из шприца выдавливается 0.5 мл опытного препарата.

б) Внутрибрюшинное введение. Животное фиксируют вниз головой, дезинфицируют место инъекции 70% спиртом и под углом 45º быстрым движением прокалывает брюшину, медленно вводят раствор препарата в брюшную полость, в объеме 0,5 мл. Для этой манипуляции используются иглы 25 — 27G.

в) Наблюдение за животными. Визуальная оценка поведения опытных животных Павших животных будут вскрывать, оценивать патологоанатомические изменения органов.

г) Взвешивание мышей. Мышей берут с помощью пинцета с силиконовыми трубками на браншах, затем плавно перемещают в ёмкость на весах. Регистрируется то показание массы тела животного, которое сохраняется без изменений на дисплее весов не менее 3 секунд, заполняется протокол взвешивания.

д) Взвешивание органов.

  1. Адъюванты: НЕТ

5.»Конечный результат» исследования: в ходе опыта будут регистрироваться признаки интоксикации опытных животных (общего состояния , потребление корма и воды), сроки гибели и макроморфологические изменения в органах при вскрытии погибших и выживших животных.

 

  1. Эвтаназия: Через 14 суток после введения препарата животные будут умерщвлены – СО2 — ингаляцией.
  2. Ветеринарное наблюдение.

7.1. Содержание животных: размещение животных и условия содержания будут соответствовать виду(мыши, крысы) в поликарбонатных микроизоляторах «LabProducts Inc.» (США) и обеспечивать стандартность проведения исследований, согласно СП2.2.1.3218-14 «Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)» от 29.08.2014г и Правил надлежащей лабораторной практики (утв. приказом Министерства здравоохранения РФ от 1 апреля 2016 г. № 199н). Животных будут содержать в контролируемых условиях окружающей среды (при температуре от 18 до 26 °C и относительной влажности воздуха от 30 до 70 %). Освещение с чередованием 12 часов света и 12 часов темноты. Воздухообмен в помещениях для содержания животных должен составлять 12-15 об/ч.

В исследовании в качестве стандартного рациона используют гранулированный полнорационные корма ПК-120 для содержания мышей и крыс по ТУ 9296-002-70941247-2005 (ООО «Лабораторкорм»). Корм и воду будут давать ad libitum.

Ежедневно будут проводить клиническое наблюдение за животными, оценивать поведенческие реакции и потребление корма и воды.

7.2. Помещение для исследований: КОРПУС № 1 ГНЦ ПМБ, четвертый этаж, виварий – 4124.

 

  1. IV. Уровень квалификации и подготовки исследователей и лаборантов.
  1. Комбарова Т.И., к.б.н., имеет 28-летний опыт в проведении биомедицинских исследований в ФБУН ГНЦ ПМБ, используя мышей, крыс, морских свинок, кроликов с возбудителями 1 -4 групп патогенности. Прошла ветеринарный тренинг по работе с лаб. животными, включая СПФ: USAAMRID, WRIAR, UHSUS. США. В 2005 г курсы повышение квалификации «Доклинические токсикологические исследования лекарственных средств (GLP)». В 2007г, окончила курсы при Саратовском противочумном институте «МИКРОБ» по работе с возбудителями особо опасных инфекций. В 2017г, повышение квалификации «Современные методы использования лабораторных грызунов в трансляционных биомедицинских исследованиях» МГУ, Москва.
  2. Рудницкая Татьяна Ивановна, н.с., имеет 35-летний опыт работы с возбудителями I — IV -й групп патогенности. В 1978 году окончила курсы специализации по особо опасным инфекциям при Ростов-на-Дону государственном научно-исследовательском противочумном институте. В 2014году окончила курсы повышения квалификации в ФБУН ГНЦ ПМБ по программе: «Лаб. диагностика острых кишечных инфекций» и курсы повышения квалификации по программе: «Биологическая безопасность и биозащита». Имеет практический опыт во всех проводимых процедурах с лабораторными животными.
  3. Мунтян Яна Олеговна, в 2017 г. окончила Ивановский государственный университет, факультет биохимии, специализировалась на кафедре физиологии человека и животных. В настоящее время – младший научный сотрудник  лаборатории молекулярной биологии. В 2018 г. получила профессиональную переподготовку в ФБУН ГНЦ ПМБ по программе «Бактериология. Основы биологической безопасности и практика работ с микроорганизмами I-IV групп патогенности. Имеет право на ведение профессиональной деятельности с использованием лабораторных животных в экспериментах (Диплом о профессиональной подготовке 502401838700, регистрационный номер 59 от 29.03.2018 г.

 

  1. Требования биобезопасности: В подготовке данного протокола были учтены все требования по работе с животными.

 

VI ГАРАНТИИ. Будучи ведущим исследователем по данному протоколу, я даю следующие гарантии:

  1. Использование животных. В отсутствие специальной санкции комитета, разрешающей отклонение от утвержденного протокола исследования, включенные в него животные будут использоваться в строгом соответствии с указанным протоколом.

 

Б.  Дублирование. Мною предприняты добросовестные усилия к тому, чтобы исключить из данного протокола ненужное дублирование предшествующих экспериментов.

 

В.  Гарантия достоверности статистического анализа. Заявляю, что я проконсультировался с компетентным специалистом, проанализировавшим статистические аспекты данного протокола, и что в исследовании будет задействовано минимальное число животных, необходимое для получения статистически достоверных научных результатов.

 

Г.   Требования биобезопасности. При подготовке данного протокола мною были учтены и проведены необходимые мероприятия по соблюдению всех применимых к нашему учреждению правил и инструкций, касающихся радиационной защиты, биобезопасности, экспериментов с генетической рекомбинацией и т. д.

 

Д.  Квалификация и подготовка сотрудников. Подтверждаю, что персонал, которому предстоит работать с животными согласно данному протоколу, имеет надлежащую квалификацию и подготовку, исключающие возможность причинения животным чрезмерной боли и страданий в результате проводимых процедур и манипуляций.

 

Е.  Ответственность. Принимаю на себя моральную и административную ответственность, связанную с использованием животных в соответствии с представленным протоколом, и подтверждаю, что все участвующие в проекте сотрудники намерены проявлять заботу о здоровье, комфорте и благополучии подопытных животных. Кроме того, я обязуюсь по возможности использовать альтернативные методы исследования, не требующие привлечения животных, и следовать принципам гуманности и соблюдения закона во время проведения научных экспериментов.

 

 

_________________________________

Дата (подпись ведущего исследователя)

 

 

Литература:

 

  1. Миронов А.Н. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств . Гриф и К, 2012.
  2. Правила надлежащей лабораторной практики (утв. приказом Министерства здравоохранения РФ от 1 апреля 2016 г. № 199н).
  3. ГОСТ12.1.007-76ССБТ. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности (с Изменениями№1,2).
  4. Хабриев Р.У. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ.  Москва, 2005 с.40-46
  5.  СП 2.2.1.3218-14 «Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)» от 29.08.2014г.
  6. МУ 2163 – 80 Методические указания к постановке исследований для обоснования санитарных стандартов.