Препарат при переломах Остеомед Форте: безопасность доказана          

В нашей стране зарегистрировано  несколько тысяч биологически активных добавок к пище отечественного и импортного производства. Приобретая их, потребить должен быть уверен не только в их эффективности, но и безопасности. Проверка последней осуществляется на животных, по её результатам препарату присваивается класс опасности. Препарат при переломах Остеомед Форте достойно выдержал все испытания, его безопасность доказана. Но обо всём – по порядку.

Остеомед Форте – натуральное средство в помощь костям

В жизни каждого человека однажды наступает период, когда деятельность половых желёз  начинает постепенно угасать. Половых гормонов, регулирующих многие жизненно важные функции организма, продуцируется всё меньше и меньше. Человек начинает замечать нарушения в работе различных органов и систем. Его мучает вялость, сонливость, быстрая утомляемость, снижение интеллектуальных способностей. Меняется осанка, рост, развивается остеопороз. Любой поход в магазин зимой может закончиться переломом, так как состояние костей, их плотность и прочность напрямую зависит от гормонального фона.

Существующие препараты, используемые в терапии остеопороза, к сожалению, далеко не безопасны. Результатом их приёма может стать гиперкальцификация мягких тканей, остеонекроз челюсти – обнажение и разрушение челюстных костей и даже рак органов репродуктивной системы.

Препарат при переломах «Остеомед Форте» – новейшая разработка отечественных учёных для восстановления и формирования структуры костной ткани, повышения её плотности, скорейшего сращивания переломов. Его основным компонентом является натуральное вещество, способствующее естественной нормализации гормонального фона.

Препарат не оказывает токсического влияния на организм человека и абсолютно безопасен даже при приёме в больших дозах. Это доказали специалисты Государственного научного центра прикладной микробиологии и биотехнологии во главе с доктором биологических наук И. Г. Шемякиным.

Как новый препарат при переломах исследовался на токсичность

Для оценки токсичности Остеомеда Форте препарат при переломах вводили лабораторным животным. Для участия в исследовании были отобраны 50 беспородных мышей и 50 крыс Wistar.

Грызуны были поделены на несколько экспериментальных (опытных) и контрольных групп. Животным опытных групп разными способами (внутрижелудочно и внутрибрюшинно) вводили раствор Остеомеда Форте. Дозировки препарата в разных экспериментальных группах варьировали от 500 до 5000 мг/кг массы тела.  Подопытным контрольных групп вводили дистиллированную воду в тех же объёмах.

Первые сутки после введения препарата за мышами и крысами осуществлялось непрерывное наблюдение. Со вторых суток грызунов ежедневно осматривали в первой половине дня. Обращалось особое внимание на их общее состояние, особенности поведения, интенсивность и характер двигательной активности, наличие и характер судорог, координацию движений, тонус скелетных мышц, состояние шерстяного и кожного покровов и некоторые другие показатели работы организма животных. Также ежедневно отслеживались малейшие изменения в весе подопытных, количество потребляемых ими воды и корма.

По окончании исследования животные были подвергнуты эвтаназии и некропсии (вскрытию) для изучения состояния органов брюшной и грудной полости.

Вывод исследователей: препарат при переломах Остеомед Форте безопасен

Исследователи зафиксировали тот факт, что животные, получавшие препарат при переломах Остеомед Форте, не отставали в весе от грызунов контрольной группы. Не было различий и в количестве потребляемых пищи и воды. Цвет, консистенция, эластичность внутренних органов крыс и мышей экспериментальных групп соответствовали норме.

На основании полученных результатов был сделан вывод: препарат Остеомед Форте относится к IV классу опасности – малоопасные. А это значит, что его приём в рекомендуемых дозировках не нанесёт вреда организму человека.

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Федеральное бюджетное учреждение науки

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ПРИКЛАДНОЙ МИКРОБИОЛОГИИ И БИОТЕХНОЛОГИИ (ФБУН ГНЦ ПМБ)

ОТЧЕТ

ОБ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИХ ИСПЫТАНИЯХ

«Исследования острого токсического действия нового лекарственного вещества ОСТЕОМЕД – Форте in vivo»

(по договору № 708-н/2018 от 12.11. 2018 г

Оболенск 2019

СПИСОК ИСПОЛНИТЕЛЕЙ

Реферат

Отчет: 27 с., 4 табл., 2 рис.

Мыши беспородные, крысы линейные Вистар (Wistar), острое токсическое действие, активные компоненты препарата «ОСТЕОМЕД Форте», ЛД50 – средняя летальная доза.

В отчете представлены результаты исследований, проведенных по договору № 708-н/2018 от 12 ноября 2018 г. между ООО «ПАРАФАРМ» и ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» (ГНЦ ПМБ).

Объектом исследования являются: комплексный препарат «ОСТЕОМЕД Форте» для профилактики и комплексной терапии остеопороза, остеопении и сопутствующих им заболеваний (артрита, артроза, остеохондроза и других патологий опорно-двигательной системы, а также пародонтита); в реабилитационный период при переломах для профилактики остеопороза и других травм костей и суставов.

Цель исследования: экспериментальное изучение острого токсического действия и определение класса опасности нового препарата ОСТЕОМЕД ФОРТЕ при однократном пероральном и парентеральном введении крысам Вистар и беспородным мышам и наблюдение за животными в течение 14 дн

Область применения  – медицина

Реферат

ОБОЗНАЧЕНИЯ, СОКРАЩЕНИЯ……………………………………………….………..5

Регулирующие стандарты………………………………………………………………….6

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

1. Материалы и методы……………………………………………………………….7
2. Программа исследований………………………………………………………….11
3. Результаты исследований………………………………………………………….16

ЗАКЛЮЧЕНИЕ……………………………………………………………………………..16

Приложение 1……………………………………………………………………………    17

Приложение 2. Ветеринарный протокол……………………………………………….   19

ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ

Регулирующие стандарты

Все работы проводились в соответствии со следующей нормативно- технической документацией:

1. СП 2.2.1.3218-14 «Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)» от 29.08.2014г;
2. Правила лабораторной практики в Российской Федерации (Приказ Министерства Здравоохранения Российской Федерации №267 от19.06.2003);
3. ГОСТ12.1.007-76ССБТ. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности (с Изменениями№1,2);
4. Хабриев Р.У. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Москва, 2005 с.40-46;
5. Миронов А.Н. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Гриф и К, 2012;
6. «Методические рекомендации по изучению общетоксического действия лекарственных средств». Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. М. Гриф и К, 2012, с. 13-24.

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

1. Материалы и методы

Реактивы и приборы

Холодильник бытовой, обеспечивающий температуру 4 °С («Stinol», Россия);

Шкаф вытяжной Ш2НЖ (Россия);

Ламинарный шкаф «Лабораторные системы» для работы с микроорганизмами 3-4 групп патогенности (Россия);

Пробирки лабораторные полипропиленовые с закручивающимися пробками вместимостью 15 мл и 50 мл, стерильные («Corning Costar», США);

Пробирки микроцентрифужные вместимостью 0,5 мл, 1,5 мл, 2,0 мл («Eppendorf», Германия);

Наконечники для регулируемых автоматических пипеток («Eppendorf» Германия);

Пипетки регулируемые автоматические вместимостью 0,5-10, 10-100, 100-1000 мкл («Eppendorf», Германия);

Пипетки стерильные пластиковые градуированные вместимостью 0,1-1,0; 2,0 мл («Corning Costar», США);

Пробирки микробиологические стеклянные по ГОСТ 1770-74;

Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ Р 51652-2000;

Перекись водорода 30 % по ГОСТ 177-88;

 Животные

Вид: крысы линейные Вистар, мыши беспородные

Пол: самцы и самки

Количество животных: крысы линейные Вистар (Wistar) – 30 голов (15 самцов и 15 самок); мыши беспородные 40 голов (20 самцов и 20 самок).

Масса тела: 175-190г, 20-23г соответственно.

Поставщик: Филиал «Андреевка» ФГБУН НЦБМТ МБА России.

 Условия содержания и кормление

Размещение животных и условия содержания будут соответствовать виду(мыши, крысы) в поликарбонатных микроизоляторах «LabProducts Inc.» (США) и обеспечивать стандартность проведения исследований, согласно СП2.2.1.3218-14 «Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)» от 29.08.2014г.

Животных содержали в контролируемых условиях окружающей среды (при температуре от 18 до 26 °C и относительной влажности воздуха от 30 до 70 %). Освещение с чередованием 12 часов света и 12 часов темноты. Воздухообмен в помещениях для содержания животных должен составлять 12-15 об/ч.

В исследовании в качестве стандартного рациона используют гранулированные полнорационные корма ПК-120 для содержания мышей и крыс, изготовленный по ТУ 9296-002-70941247-2005 (ООО «Лабораторкорм»). Корм и воду давали ad libitum.

 Обеспечение соблюдения принципов гуманного обращения с подопытными животными

Все предполагаемые в данном исследовании манипуляции с животными, а также условия их кормления и содержания одобрены биоэтической комиссией.

Схема эксперимента при определении острой токсичности, обоснование выбора тест-системы, условий применения и введения тестируемого вещества.

В качестве лабораторных моделей использовали опытные и контрольные группы животных (крысы линейные Вистар и беспородные мыши), широко используемые в исследованиях безопасности новых лекарственных средств.

Лекарственное средство «ОСТЕОМЕД Форте» оказывает многоуровневое действие: способствует регуляции фосфорно-кальциевого обмена, эффективному и безопасному восстановлению и формированию структуры костной ткани; подавляет костную резорбцию и стимулирует остеогенез; увеличивает минеральную плотность костной ткани. Являясь источником природных прогормонов, препарат способствует безопасной нормализации гормонального фона и формированию коллагена.

Исследуемый препарат предназначен для перорального применения взрослым по 2 таблетки массой 500мг 2 раза в день во время еды. Продолжительность приема – 1 месяц.

У мелких лабораторных животных токсичность фармакологического вещества исследуют при нескольких путях введения, перорально – путь, при котором была показана специфическая активность средства «ОСТЕОМЕД Форте». Парентеральный путь введения может дать ориентировочные данные о скорости и степени всасывания средства.

Общие условия распределения животных по группам и дозирования препарата «ОСТЕОМЕД Форте» приведены в таблице 1.

Табл. 1. Расчет доз для перорального и парентерального (внутрибрюшинного) введения препарата «Остеомед форте».

Полученные результаты должны обеспечить возможность вычисления ЛД₅₀ – средней летальной дозы, которая вызывает гибель 50% подопытных животных при однократном введении в желудок, с последующим 14- дневным сроком наблюдения. Если препарат обладает низкой токсичностью, тогда следует указать максимальную дозу, которая вводилась животным, но не менее 2 г/кг.

Распределение по группам и идентификация животных

Животные были распределены по группам рандомизированно, с использованием в качестве основного критерия величину массы тела таким образом чтобы различия в массе тела между особями одного пола не превышали 20%.

Идентификация животных была произведена методом этикирования клеток.

Методы исследования

Прижизненные манипуляции с животными.

В первый день после введения препарата животные находились под непрерывным наблюдением, а далее осуществляли ежедневный осмотр животных в первой половине дня в течение 14 суток. Массу тела животных определяли ежедневно в течение 7 суток и по окончанию срока наблюдения на 14 сутки. Определяли поедаемость корма и воды в течение 3-х первых суток с начала исследования.

Патоморфологическая картина

Массу тела, определенную после ночи голодания перед некропсией, использовали для определения массовых коэффициентов органов (масса органа в граммах в расчете на 1кг массы тела).

Предмет исследований

Предметом исследований является:

«ОСТЕОМЕД Форте» –  комплексный препарат для профилактики и комплексной терапии остеопороза, остеопении и сопутствующих им заболеваний (артрита, артроза, остеохондроза и других патологий опорно-двигательной системы, а также пародонтита); в реабилитационный период при переломах, для профилактики остеопороза и других травм костей и суставов.

Исследуемые препараты

В ходе исследования использовали двукратные серийные разведения исследуемого препарата «ОСТЕОМЕД ФОРТЕ» (таблетка и отдельные активные компоненты без наполнителя – премикс).

Табл. 2. Рецептура препарата «ОСТЕОМЕД ФОРТЕ» по ТУ 9197-060-41395157-12 с изм. № 1

 Описание и характеристики исследуемого препарата.

«ОСТЕОМЕД  Форте» – таблетка круглой формы, с гладкой поверхностью, белого с желтоватыми вкраплениями цвета.

Состав: каждая таблетка содержит:

Витамин В₆ (пиридоксина гидрохлорид)(0,5мг)

Витамин D₃ (холекальциферол)(3,75мкг)

Цитрат кальция(250мг)

Органический анаболический компонент природного происхождения (гомогенат трутневый с витамином В₆), адсорбированный на глюкозе(50мг).

Вспомогательные вещества: лактоза(188,0), кальций стеариновокислый(10,0мг)(добавка, препятствующая слеживанию и комкованию).

2. Программа исследований

План исследования и его дизайн разработаны в соответствии с «Методическими рекомендациями по изучению общетоксического действия лекарственных средств». Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая.- М. Гриф и К, 2012.-с. 13-24.

В доклиническом исследовании по изучению острой токсичности препарата «ОСТЕОМЕД ФОРТЕ» целью является определение переносимых и летальных доз вещества и причин наступления гибели животных с анализом клинической картины интоксикации при однократном введении исследуемого вещества.

В экспериментальном исследовании в качестве тест-систем взяты крысы Вистар и беспородные мыши, широко используемые при испытаниях  безопасности новых лекарственных средств.

С учетом назначения, условий применения в программу исследований препарата  «ОСТЕОМЕД ФОРТЕ», производитель ООО «ПАРАФАРМ» входило: оценка острой токсичности при разных путях поступления в организм (перорально и парентерально).

2.1. Ключевые даты исследования

Дата начала исследования: 17.05.2019 г.

Дата окончания исследования: 30.05.2019 г.

2.2 Ответственные за выполнение этапов исследования:

Формирование групп животных, введение препарата, клинические наблюдения:  Комбарова Т.И., Рудницкая Т.И.

2.2. Обеспечение условий содержания и кормления животных, ветеринарный контроль: Комбарова Т.И., Рудницкая Т.И., Мунтян Я.О.

План исследования и его дизайн разработаны в соответствии с «Методическими рекомендациями по изучению общетоксического действия лекарственных средств». Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая.- М. Гриф и К, 2012.-с. 13-24.

 2.3. Схема эксперимента по определению острой токсичности, обоснование выбора тест-системы, условий применения и введения тестируемого вещества.

В качестве лабораторных моделей использовали опытные и контрольные группы животных (крысы Вистар и беспородные мыши), широко используемые в исследованиях безопасности новых лекарственных средств.

Лекарственное средство «ОСТЕОМЕД Форте» оказывает многоуровневое действие: способствует регуляции фосфорно-кальциевого обмена, эффективному и безопасному восстановлению и формированию структуры костной ткани; подавляет костную резорбцию и стимулирует остеогенез; увеличивает минеральную плотность костной ткани. Являясь источником природных прогормонов, препарат способствует безопасной нормализации гормонального фона и формированию коллагена.

Исследуемый препарат предназначен для перорального применения взрослым по 2 таблетки массой 500мг 2 раза в день во время еды. Продолжительность приема – 1 месяц.

У мелких лабораторных животных токсичность фармакологического вещества исследуют при нескольких путях введения, перорально – путь, при котором была показана специфическая активность средства ОСТЕОМЕД Форте и парентеральном пути введения, который может дать ориентировочные данные о скорости и степени всасывания средства.

Общие условия распределения животных по группам и дозирования препарата Остеомед форте приведены в таблице 1.

Табл. 1. Расчет доз для перорального и парентерального (внутрибрюшинного) введения препарата «Остеомед форте».

Полученные результаты должны обеспечить возможность вычисления ЛД₅₀ – средней летальной дозы, которая вызывает гибель 50% подопытных животных при однократном введении в желудок, с последующим 14- дневном сроком наблюдения. Если препарат обладает низкой токсичностью, тогда следует указать максимальную дозу, которая вводилась животным, но не менее 2 г/кг.

3. Результаты

 Оценка острой токсичности препарата  «ОСТЕОМЕД Форте».

Изучение острой токсичности препарата «ОСТЕОМЕД Форте» проводили на крысах линии Вистар и на белых беспородных мышах (самках и самцах, массой тела 180 – 195 и 20 – 22 грамма соответственно).  Исследуемый препарат вводили внутрижелудочно крысам в объеме 3 мл и мышам в объеме 0.5 мл, контрольным животным вводили дистиллированную воду в том же объёме. Мышам дополнительной группы вводили исследуемый препарат внутрибрюшинно в объеме 0.5 мл (оценивали степень проникновения в паренхиматозные органы).

На протяжении всего периода (24 часа) наблюдения гибели животных не было зарегистрировано, не отмечалось изменений внешнего вида, поведения, двигательной активности по сравнению с контрольной группой животных.

Изучение острой токсичности препарата «ОСТЕОМЕД Форте» проводили на крысах Вистар и на белых беспородных мышах (самках и самцах, массой тела 180 – 195 и 20 – 22 грамма соответственно).  Исследуемый препарат вводили внутрижелудочно крысам в объеме 3 мл и мышам в объеме 0.5 мл, контрольным животным вводили дистиллированную воду в том же объёме. Мышам дополнительной группы вводили исследуемый препарат внутрибрюшинно в объеме 0.5 мл (оценивали степень проникновения в паренхиматозные органы).

На протяжении всего периода (24 часа) наблюдения гибели животных не было зарегитрировано, не отмечалось изменений внешнего вида, поведения, двигательной активности по сравнению с контрольной группой животных.

В период наблюдения проводили учет веса тела животных. Данные учета веса тела животных представлены в таблице 2.

Табл.  2 . Динамика изменения веса тела крыс и мышей при оценке острой токсичности препарата «Остеомед форте».

Вес экспериментальных животных независимо от дозы препарата и пути введения был сопоставим с группой контроля, что указывает на безвредность испытуемого препарата «Остеомед форте».

Для характеристики токсического действия препарата «Остеомед форте» учитывали потребление корма и воды. Данные учета потребления корма представлены в таблице 3.

Табл. 3. Потребление корма и воды животными после однократного внутрижелудочного введения биологически активной добавки «Остеомед форте» в первых 3-х суток наблюдения.

Полученные данные свидетельствуют о том, что количество съеденного корма и употребление воды соответствует нормам суточного употребления корма и воды в контрольной группе.

По окончании эксперимента провели эвтаназию животных СО₂ – ингаляцией с визуальным макроскопическим исследованием внутренних органов животных и определением относительной массы органов.

На вскрытии животных макроскопических патологических изменений внутренних органов и тканей подопытных животных не выявлено. Органы расположены в брюшной и грудной полости свободно, признаков воспаления брюшины и кишечника не отмечено.

Рис. 1. Брюшная и грудная полость крысы Вистар при дозе введения 5000мг/кг препарата  «Остеомед форте».

Рис. 2. Брюшная и грудная полость мыши при дозе введения 5000мг/кг препарата добавки «Остеомед форте»

При патологоанатомическом осмотре состояние органов брюшной и грудной полости  было без отклонений от нормы (селезенка темно-красного цвета, эластичная, с блестящей прозрачной капсулой; печень красно-коричневого цвета, поверхность блестящая, консистенция плотная;  почки темные, красно-коричневого цвета,

консистенция плотно-эластичная; легкие светло-розовые, воздушные, эластичные, висцеральная плевра – гладкая и блестящая).

Для оценки состояния внутренних органов использовали массовый коэффициент (МК) – процентное отношение массы органа к массе тела.

Расчет массовых коэффициентов производили по формуле:

МК = Масса органа (г)/ масса тела) × 100%, этот показатель при токсикологических исследованиях дает возможность обнаружения органа – мишени.

Таблица 4. Относительная масса органов крыс и мышей опытных и контрольных групп, в %      (М±m), n=5.

Таким образом, из приведенных в таблице 4 данных данных следует, что  относительная масса органов крыс и мышей не имеют достоверных отличий от аналогичных показателей контрольных животных.

 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Препарат «ОСТЕОМЕД Форте» изготовителя ООО «Парафарм» по показателю «среднелетальная доза (ЛД 50 больше 5000)» относится к IV классу опасности – малоопасные.

Литература.

1. СП 2.2.1.3218-14 «Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)» от 29.08.2014г.
2. Правила лабораторной практики в Российской Федерации (Приказ Министерства Здравоохранения Российской Федерации №267 от19.06.2003);
3. ГОСТ12.1.007-76ССБТ. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности (с Изменениями№1,2).
4. Хабриев Р.У. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Москва, 2005 с.40-46
5. Миронов А.Н. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств . Гриф и К, 2012.
6. ГОСТ ISO 10993-11-2011. Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть11. Исследования общетоксического действия.
7. МУ 2163 – 80 Методические указания к постановке исследований для обоснования санитарных стандартов.
8. Лист данных по безопасности. Цинкосодержащая антибактериальная композиция. Раздел 11: Токсикологическая информация. 18.09.18г.

Приложение1

ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО НАДЗОРУ В СФЕРЕ ЗАЩИТЫ ПРАВ ПОТРЕБИТЕЛЕЙ И БЛАГОПОЛУЧИЯ ЧЕЛОВЕКА

Федеральное бюджетное учреждение науки

«Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии»

Московская область, Серпуховский округ, Оболенск,

Результаты токсикологических исследований in vivo

1. Наименование предприятия, организации : ООО «ПАРАФАРМ»
2. Юридический адрес: 440026, г. Пенза, ул. Свердлова, д. 4
3. Изготовитель (фирма, предприятие, организация): ООО «ПАРАФАРМ», 440026, г. Пенза, ул. Калинина 116 А

Страна: Россия.

6. Место отбора: ООО «ПАРАФАРМ», 440026, г. Пенза, ул. Калинина 116А
7. Время и даты отбора: 13.05. 2019

8. Средства измерений:

9. Дополнительные сведения:

Образец представлен в приспособленной маркировке из полимерного материала с маркировкой на поверхности тары. Внешний вид: таблетки

РЕЗУЛЬТАТЫ ИСПЫТАНИЙ (ИССЛЕДОВАНИЙ)

Приложение 2

НАЗВАНИЕ ПРОТОКОЛА: «Исследование острого токсического действия нового лекарственного препарата ОСТЕОМЕД-Форте in vivo»

ВЕДУЩИЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬ:

Зам директора по научной работе ФБУН ГНЦ ПМБ,

д.б.н., проф. Шемякин И.Г. (тел 36-00-60)                       __________________________

ПОМОЩНИК ВЕДУЩЕГО ИССЛЕДОВАТЕЛЯ:

с.н.с. лаборатории молекулярной биологии,

к.м.н.Манзенюк О.Ю.                                                        _________________________

УЧАСТВУЮЩИЙ/КОНСУЛЬТИРУЮЩИЙ ВЕТЕРИНАР:

с.н.с. лаборатории биологических испытаний,

к.б.н. Комбарова Т.И.                                                         __________________________

ПРЕДСЕДАТЕЛЬ КОМИССИИ ПО БИОЭТИКЕФБУН ГНЦ ПМБ:

г.н.с.отдела молекулярной микробиологии,

д.в.н., проф. Светоч Э.А.                                                   __________________________

Название протокола: «Исследование острого токсического действия нового лекарственного препарата ОСТЕОМЕД-Форте in vivo»

Ведущий исследователь:  заместитель директора д.б.н. Шемякин И.Г.;

Помощник ведущего исследователя: старший научный сотрудник  к.м.н. лаборатории молекулярной биологии Манзенюк О.Ю.;

Ассистирующие исследователи: Комбарова Т.И., Рудницкая Т.И., Мунтян Я.О.

1. РЕЗЮМЕ:

Цель – Экспериментальное изучение острого токсического действия нового лекарственного препарата ОСТЕОМЕД-Форте при пероральном и парентеральном применении на лабораторных животных. Определение класса опасности исследуемого нового лекарственного препарата ОСТЕОМЕД-Форте.

1. ПРЕДПОСЫЛКИ К ПРОВЕДЕНИЮ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Современные тенденции доклинических токсикологических исследований фармакологического вещества предполагают установление характера и выраженности его повреждающего действия на организм экспериментальных животных и оценку его безопасности. Первоначально проводят оценку острой токсичности фармакологического вещества, целью которой является определение переносимых, токсических и летальных доз (с использованием статистических методов) и анализ клинической картины интоксикации.

У мелких лабораторных животных токсичность фармакологического вещества исследуют при нескольких путях введения. Фармакологические вещества, предназначенные для системного введения, вводят перорально и парентерально (внутрибрюшинно, если они не растворимы в воде, внутривенно и подкожно, если они растворимы). Сравнение параметров токсичности при разных путях введения может выявить скорость и степень всасывания препарата и позволяет судить о сходстве или различии в механизмах, вызывающих летальный исход при разных путях введения. [1]

С учетом назначения и условий применения в программу исследований биологически активной добавки к пище «ОСТЕОМЕД Форте», (производитель ООО «ПАРАФАРМ») планируется провести:

1. Оценку острой токсичности при разных путях поступления в организм: в желудок и парентерально в брюшную полость для сравнения токсического действия на организм животных.
2. Определение массы тела животных.
3. Определение внешних признаков интоксикации, макроскопической оценки органов.

III.      МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Схема проведения экспериментов и общие процедуры:

1.1 Оценка острой токсичности препарата «Остеомед форте» при внутрижелудочном введении.

Для оценки острой токсичности «Остеомед форте», (производитель ООО «ПАРАФАРМ») и для определения переносимых, токсических и летальных доз с выявлением клинической картины интоксикации будут использоваться два вида животных (беспородные мыши и крысы Вистар) [1].

Для решения поставленных задач и определения LD₅₀ при внутрижелудочном введении будут использовать 4 дозы препарата [ГОСТ12.1.007-76ССБТ] (таблица1).

Раствор препарата «Остеомед форте» опытным животным будут вводить в объеме 0,5 мл мышам и 3 мл крысам с учетом веса животных (20±2 г и 180-190 г соответственно).

На дозу препарата будут использовать по 10 экспериментальных животных (5 самцов и 5 самок в группе).

Таблица 1. Учет гибели животных

В первый день после введения препарата животные будут находиться под непрерывным наблюдением.

Регулярно в течение 14 суток будет проводиться наблюдение и будут фиксировать общее состояние животных, особенности их поведения, интенсивность и характер двигательной активности, наличие и характер судорог, координацию движений, тонус скелетных мышц, состояние шерстного и кожного покрова, консистенцию фекальных масс, окраску мочи, потребление воды и корма.

Будет учитываться гибель животных.

Все павшие животные будут подвергаться некропсии с оценкой  макроморфологических изменений в органах.

С целью учета реакции организма на токсическое действия препарата будут проводить оценку массы тела животных: ежедневно в течение 7 суток и на 14 сутки.

Выживших животных будут эвтанизировать и проводить некропсию с макроскопическим описанием органов и тканей места введения (степень кровенаполнения органов и наличия кровоизлияний, изъязвлений слизистых оболочек) и будут определять относительную массу органов.

Всего при оценке острой пероральный токсичности будет использовано  50 мышей и 50 крыс.

1.2 Оценка токсичности препарата «Остеомед форте» при парентеральном (внутрибрюшинном) введении.

Для данной процедуры будут использовать «Остеомед форте» в максимальной концентрации 5000мг/кг при внутрибрюшинном введении.

В эксперименте будут использованы беспородные мыши, весом 22-24г, самцы и самки по 5 штук.

Будет проводиться наблюдение и оценка физических показателей.

Всего используется: 10 беспородных мышей.

2. Экспериментальные животные и обоснование заказа.

Не применимо

2.1. Анализ альтернативных вариантов без использования животных:

Исследование острого токсического действия новых препаратов проводится с использованием лабораторных животных согласно ГОСТ12.1.007-76ССБТ и др. [2-6].

2.2. Лабораторные животные.

а) Род и вид: Мышь (Mus musculus), крыса(Rattus)

б) Линия (порода): мыши, крысы, – беспородные

(поставщик): Филиал «Андреевка» ФГБУН НЦБМТ МБА России

г) Возраст 8-10 недель мыши, крысы.

в) Вес: 20 – 24 г мышь; 180-190г крыса.

е) Пол: самки, самцы.

ж) Особые требования:НЕТ

з) Прочее: НЕТ

2.3. Общее необходимое число животных: мыши –60шт; крысы -50шт.

Замена: НЕТ

3. Технические методы.

3.1. Длительная фиксация: НЕТ

3.2. Хирургические вмешательства: НЕТ

3.3. Наркоз:  НЕТ

3.4. Манипуляции с животными.

3.4.1 Эксперименты с животными проводят в соответствии с СП 2.2.1.3218-14 «Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)» Правила надлежащей лабораторной практики (утв. приказом Министерства здравоохранения РФ от 1 апреля 2016 г. № 199н. Манипуляции с животными будут проводить в специально изолированной комнате для заражений.

3.4.2 Идентификация животных: мыши, крысы будут содержаться группами в клетках соответствующей площади. На клетки вывешиваются этикетки с указанием ответственного исполнителя, номера проекта, номера группы, вида, линии и количества животных, наименования и даты проведения процедуры.

3.4.3 Инъекции:

а) Внутрижелудочное введение. Процедура для оценки острой токсичности будут проводить при помощи тонкого металлического зонда с напаянной на конце оливой. Мышь фиксируется левой рукой за кожную складку шеи и корень хвоста. Для фиксации крысы используются перчатки – краги. Правой рукой зонд вводится в ротовую полость и медленно из шприца выдавливается 0.5 мл опытного препарата.

б) Внутрибрюшинное введение. Животное фиксируют вниз головой, дезинфицируют место инъекции 70% спиртом и под углом 45º быстрым движением прокалывает брюшину, медленно вводят раствор препарата в брюшную полость, в объеме 0,5 мл. Для этой манипуляции используются иглы 25 – 27G.

в) Наблюдение за животными. Визуальная оценка поведения опытных животных Павших животных будут вскрывать, оценивать патологоанатомические изменения органов.

г) Взвешивание мышей. Мышей берут с помощью пинцета с силиконовыми трубками на браншах, затем плавно перемещают в ёмкость на весах. Регистрируется то показание массы тела животного, которое сохраняется без изменений на дисплее весов не менее 3 секунд, заполняется протокол взвешивания.

д) Взвешивание органов.

4. Адъюванты: НЕТ

5.”Конечный результат” исследования: в ходе опыта будут регистрироваться признаки интоксикации опытных животных (общего состояния , потребление корма и воды), сроки гибели и макроморфологические изменения в органах при вскрытии погибших и выживших животных.

6. Эвтаназия: Через 14 суток после введения препарата животные будут умерщвлены – СО₂ – ингаляцией.
7. Ветеринарное наблюдение.

7.1. Содержание животных: размещение животных и условия содержания будут соответствовать виду(мыши, крысы) в поликарбонатных микроизоляторах «LabProducts Inc.» (США) и обеспечивать стандартность проведения исследований, согласно СП2.2.1.3218-14 «Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)» от 29.08.2014г и Правил надлежащей лабораторной практики (утв. приказом Министерства здравоохранения РФ от 1 апреля 2016 г. № 199н). Животных будут содержать в контролируемых условиях окружающей среды (при температуре от 18 до 26 °C и относительной влажности воздуха от 30 до 70 %). Освещение с чередованием 12 часов света и 12 часов темноты. Воздухообмен в помещениях для содержания животных должен составлять 12-15 об/ч.

В исследовании в качестве стандартного рациона используют гранулированный полнорационные корма ПК-120 для содержания мышей и крыс по ТУ 9296-002-70941247-2005 (ООО «Лабораторкорм»). Корм и воду будут давать ad libitum.

Ежедневно будут проводить клиническое наблюдение за животными, оценивать поведенческие реакции и потребление корма и воды.

7.2. Помещение для исследований: КОРПУС № 1 ГНЦ ПМБ, четвертый этаж, виварий – 4124.

1. IV. Уровень квалификации и подготовки исследователей и лаборантов.

1. Комбарова Т.И., к.б.н., имеет 28-летний опыт в проведении биомедицинских исследований в ФБУН ГНЦ ПМБ, используя мышей, крыс, морских свинок, кроликов с возбудителями 1 -4 групп патогенности. Прошла ветеринарный тренинг по работе с лаб. животными, включая СПФ: USAAMRID, WRIAR, UHSUS. США. В 2005 г курсы повышение квалификации «Доклинические токсикологические исследования лекарственных средств (GLP)». В 2007г, окончила курсы при Саратовском противочумном институте «МИКРОБ» по работе с возбудителями особо опасных инфекций. В 2017г, повышение квалификации «Современные методы использования лабораторных грызунов в трансляционных биомедицинских исследованиях» МГУ, Москва.
2. Рудницкая Татьяна Ивановна, н.с., имеет 35-летний опыт работы с возбудителями I – IV -й групп патогенности. В 1978 году окончила курсы специализации по особо опасным инфекциям при Ростов-на-Дону государственном научно-исследовательском противочумном институте. В 2014году окончила курсы повышения квалификации в ФБУН ГНЦ ПМБ по программе: «Лаб. диагностика острых кишечных инфекций» и курсы повышения квалификации по программе: «Биологическая безопасность и биозащита». Имеет практический опыт во всех проводимых процедурах с лабораторными животными.
3. Мунтян Яна Олеговна, в 2017 г. окончила Ивановский государственный университет, факультет биохимии, специализировалась на кафедре физиологии человека и животных. В настоящее время – младший научный сотрудник  лаборатории молекулярной биологии. В 2018 г. получила профессиональную переподготовку в ФБУН ГНЦ ПМБ по программе «Бактериология. Основы биологической безопасности и практика работ с микроорганизмами I-IV групп патогенности. Имеет право на ведение профессиональной деятельности с использованием лабораторных животных в экспериментах (Диплом о профессиональной подготовке 502401838700, регистрационный номер 59 от 29.03.2018 г.

1. Требования биобезопасности: В подготовке данного протокола были учтены все требования по работе с животными.

VI ГАРАНТИИ. Будучи ведущим исследователем по данному протоколу, я даю следующие гарантии:

1. Использование животных. В отсутствие специальной санкции комитета, разрешающей отклонение от утвержденного протокола исследования, включенные в него животные будут использоваться в строгом соответствии с указанным протоколом.

Б.  Дублирование. Мною предприняты добросовестные усилия к тому, чтобы исключить из данного протокола ненужное дублирование предшествующих экспериментов.

В.  Гарантия достоверности статистического анализа. Заявляю, что я проконсультировался с компетентным специалистом, проанализировавшим статистические аспекты данного протокола, и что в исследовании будет задействовано минимальное число животных, необходимое для получения статистически достоверных научных результатов.

Г.   Требования биобезопасности. При подготовке данного протокола мною были учтены и проведены необходимые мероприятия по соблюдению всех применимых к нашему учреждению правил и инструкций, касающихся радиационной защиты, биобезопасности, экспериментов с генетической рекомбинацией и т. д.

Д.  Квалификация и подготовка сотрудников. Подтверждаю, что персонал, которому предстоит работать с животными согласно данному протоколу, имеет надлежащую квалификацию и подготовку, исключающие возможность причинения животным чрезмерной боли и страданий в результате проводимых процедур и манипуляций.

Е.  Ответственность. Принимаю на себя моральную и административную ответственность, связанную с использованием животных в соответствии с представленным протоколом, и подтверждаю, что все участвующие в проекте сотрудники намерены проявлять заботу о здоровье, комфорте и благополучии подопытных животных. Кроме того, я обязуюсь по возможности использовать альтернативные методы исследования, не требующие привлечения животных, и следовать принципам гуманности и соблюдения закона во время проведения научных экспериментов.

_________________________________

Дата (подпись ведущего исследователя)

Литература:

1. Миронов А.Н. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств . Гриф и К, 2012.
2. Правила надлежащей лабораторной практики (утв. приказом Министерства здравоохранения РФ от 1 апреля 2016 г. № 199н).
3. ГОСТ12.1.007-76ССБТ. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности (с Изменениями№1,2).
4. Хабриев Р.У. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ.  Москва, 2005 с.40-46
5.  СП 2.2.1.3218-14 «Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)» от 29.08.2014г.
6. МУ 2163 – 80 Методические указания к постановке исследований для обоснования санитарных стандартов.