Исследование подострого токсического действия нового лекарственного вещества ОСТЕОМЕД ФОРТЕ invivo. Часть 2. Определение уровня гематологических и биохимических показателей крови у подопытных крыс

Федеральная служба по надзору в сфере
защиты прав потребителей и благополучия человека

Федеральное бюджетное учреждение науки

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ПРИКЛАДНОЙ МИКРОБИОЛОГИИ И БИОТЕХНОЛОГИИ (ФБУН ГНЦ ПМБ)

ОТЧЕТ

ОБ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИХ ИСПЫТАНИЯХ

«Исследование подострого токсического действия нового лекарственного вещества ОСТЕОМЕД ФОРТЕ invivo. Часть 2.Определение уровня гематологических и биохимических показателей крови у подопытных крыс».

(по договору № 709-н/2018 от 12.11. 2018 г.)

Оболенск 2019

СПИСОК ИСПОЛНИТЕЛЕЙ

Реферат

Отчет: 22 с.,  5табл., 0 рис.

Ключевые слова: крысы линейные Вистар (Wistar), активные компоненты препарата «ОСТЕОМЕД ФОРТЕ», подострая токсичность.

В отчете представлены результаты исследований, проведенных по договору № 709-н/2018 от 12 ноября 2018 г. между ООО «ПАРАФАРМ» и ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» (ГНЦ ПМБ).

Современные стандарты доклинических токсикологических исследований фармакологического вещества предполагают установление характера и выраженности его повреждающего действия на организм экспериментальных животных и оценку его безопасности. Целью исследования подострой токсичности лекарственного средства является характеристика повреждающего действия препарата при его длительном введении, выявление наиболее чувствительных органов, а также исследование возможности обратимости вызываемых повреждений [1-5].

Объектом исследования явился препарат «ОСТЕОМЕД ФОРТЕ» для профилактики и комплексной терапии остеопороза, остеопении и сопутствующих им заболеваний (артрита, артроза, остеохондроза и других патологий опорно-двигательной системы, а также пародонтита); в реабилитационный период при переломах для профилактики остеопороза и других травм костей и суставов.  Область применения  -медицина.

Цель исследования: экспериментальное изучение подострого токсического действия  нового препарата ОСТЕОМЕД ФОРТЕ при многократном пероральном введении  крысам Вистарв течение 30 дней.

Оценку влияния исследуемого препарата на крыс проводили на основании результатов клинического наблюдения, а также анализа гематологических, биохимических и коагулологических показателей крови.

Реферат

ОБОЗНАЧЕНИЯ, СОКРАЩЕНИЯ……………………………………………….………..

Регулирующие стандарты………………………………………………………………….

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

1. Материалы и методы……………………………………………………………….
2. Программа исследований………………………………………………………….
3. Результаты исследований………………………………………………………….

ЗАКЛЮЧЕНИЕ………………………………………………………………………………

Список литературы…………………………………………………………………………

Приложение 1………………………………………………………………………………

Приложение 2 Ветеринарный протокол

ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ

peros……………………. пероральное (внутрижелудочное) введение

МЕ……………………. международные единицы

Регулирующие стандарты

Все работы проводились в соответствии со следующей нормативно- технической документацией:

1. СП 2.2.1.3218-14 «Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)» от 29.08.2014г;
2. Правила лабораторной практики в Российской Федерации (Приказ Министерства Здравоохранения Российской Федерации № 199н от 01.04.2016);
3. ГОСТ 12.1.007-76 ССБТ. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности (с Изменениями№1,2);

4.5. 6. «Методические рекомендации по изучению общетоксического действия лекарственных средств». Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. М. Гриф и К, 2012, стр. 13-24;

7. Директива Совета Европы – 2010/63 EU;

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

1. Материалы и методы

Реактивы и приборы

Центрифуга с охлаждением Centifuge 5430 R (Eppendorf, Германия)

Ламинарный шкаф «Лабораторные системы» для работы с микроорганизмами 3-4 групп патогенности (Россия);

Автоматический анализатор PCE-90Vet (HighTechnology, USA);

Автоматический анализаторMiuraDA, ISERoma-Italia;

Коалулометр Sysmax CA50, Siemens, Германия;

Пробирки микроцентрифужные вместимостью 1,5 мл, («Eppendorf», Германия) с ЭДТА;

Пробирки микроцентрифужные вместимостью 1,5 мл, («Eppendorf», Германия)с цитратом натрия 3,8 %;

Наконечники для регулируемых автоматических пипеток («Eppendorf» Германия);

Пипетки регулируемые автоматические вместимостью 0,5-10, 10-100, 100-1000 мкл («Eppendorf», Германия);

Пипетки стерильные пластиковые градуированные вместимостью 0,1-1,0; 2,0 мл («CorningCostar», США);

Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ Р 51652-2000;

Перекись водорода 30 % по ГОСТ 177-88;

Животные

Вид: крысы линейные Вистар/Wistar

Пол: самцы и самки

Возраст: 8-10 недель

Количество животных: крысы линейные Вистар (Wistar) – 30 голов (15 самцов и 15 самок);

Масса тела: 175-190г

Поставщик: Филиал «Андреевка» ФГБУН НЦБМТ МБА России.

Условия содержания и кормление

Животных содержали в контролируемых условиях окружающей среды (при температуре от 18 до 26 °C и относительной влажности воздуха от 30 до 70 %) в поликарбонатных микроизоляторах «LabProductsInc.» (США), с режимом освещения 12 часов день/12 часов ночь.. Воздухообмен в помещениях для содержания животных составлял12-15 об/ч.

В исследовании в качестве стандартного рациона использовали гранулированный полнорационный корм ПК-120 для содержания мышей и крыс, изготовленный по ТУ 9296-002-70941247-2005 (ООО «Лабораторкорм»). Корм и воду давали adlibitum.

Обеспечение соблюдения принципов гуманного обращения с подопытными животными

Все манипуляции с животными в данном исследовании, а также условия их кормления и содержания были заранее одобрены биоэтической комиссией ФБУН ГНЦ ПМБ.

Эвтаназия

Животные в конце эксперимента эвтаназированы с помощью СО₂ – ингаляции (Директива Совета Европы – 2010/63 EU).

Гематологическое исследование крови

Через 24 часа после последнего введения препарата ОСТЕОМЕД ФОТРЕ была проведена эвтаназия животных СО₂ ингалаяцией и забор крови из сердца с помощью иглы 25 размера. Образцы крови, объемом 400 мкл, отбирали на 31 день после начала приема препарата ОСТЕОМЕД ФОРТЕ и вносили в пробирки эппендорф, содержащие Кa 3 ЭДТА 1,8 мг/1 мл крови.

Количественные показатели крови определяли с помощью автоматического анализатора PCE-90Vet (HighTechnology, USA).

Биохимическое исследование сыворотки крови

500 мкл крови каждого образца вносили в пробирки эппендорф, помещали в холодильник +4С на ночь. На следующее утро пробирки с образцами крови центрифугировали в течение 10 мин 3 тыс. об/мин при температуре +4С. Полученную сыворотку аккуратно отбирали и переносили в стерильную пробирку эппендорф для биохимического исследования.

Количественные показатели сыворотки крови определяли с помощью биохимического автоматического анализатора MiuraDA, ISERoma-Italia.

Коагулологические исследования крови

Образцы крови, объемом 300 мкл, отбирали на 31 день после начала приема препарата ОСТЕОМЕД ФОРТЕ в пробирки эппендорф с 30 мкл 3,8% раствора цитрата натрия для получения плазмы крови. Количественные показатели образцов плазмы крови измеряли с помощью коагулометраSysmexCA-50 (Siemens, Германия).

Объект исследований

Объектом исследований является:

«ОСТЕОМЕД ФОРТЕ» – биологически активная пищевая добавка «ОСТЕОМЕД ФОРТЕ» является фиксированной комбинацией действующих веществ (таблица 1). Оказывает многоуровневое действие: способствует регуляции фосфорно-кальциевого обмена, эффективному и безопасному восстановлению и формированию структуры костной ткани; подавляет костную резорбцию и стимулирует остеогенез; увеличивает минеральную плотность костной ткани. Являясь источником природных прогормонов, препарат способствует безопасной нормализации гормонального фона и формированию коллагена.

Исследуемый препарат предназначен для перорального применения взрослым по 2 таблетки массой 500мг 2 раза в день во время еды. Продолжительность приема – 1 месяц.

В ходе исследования на крысах препарат «ОСТЕОМЕД ФОРТЕ» (таблетка) в использовали дозах 2000 мг/кг, 200 мг/кг.

Табл. 1. Рецептура препарата «ОСТЕОМЕД ФОРТЕ» по ТУ 9197-060-41395157-12 с изм. № 1

2.Программа исследований

1. Ключевые даты исследования

Дата начала исследования: 31.05.2019 г.

Планируемая дата окончания исследования: 01.07.2019 г.

2. Ответственные за выполнение этапов исследования:

• Формирование групп животных, введение препарата, клинические наблюдения – Комбарова Т.И., Рудницкая Т.И.
• Определение уровня гематологических показателей периферической крови – Комбарова Т.И., Рудницкая Т.И
• Определение уровня биохимических показателей сыворотки крови- Комбарова Т.И., Рудницкая Т.И
• Определение коагулологических показателей плазмы крови- Комбарова Т.И., Рудницкая Т.И
• Обеспечение условий содержания и кормления животных, ветеринарный контроль – Комбарова Т.И., Рудницкая Т.И.

3. Цель исследования

Цель исследования: экспериментальное изучение подострого токсического действия  нового препарата ОСТЕОМЕД ФОРТЕ при многократном пероральном введении  крысам Вистар в течение 30 дней.

4. Обеспечение соблюдения принципов гуманного обращения с подопытными животными

Все предполагаемые в данном исследовании манипуляции с животными, а также условия их кормления и содержания одобрены биоэтической комиссией ФБУН ГНЦ ПМБ.

5. Схема эксперимента при определении подострой токсичности, обоснование выбора тест-системы, условий применения и введения тестируемого вещества.

В качестве лабораторных моделей были взяты опытные и контрольные группы животных (крысы линейные Вистар/Wistar) , широко используемые в исследованиях безопасности новых лекарственных средств.

Препарат ОСТЕОМЕД ФОРТЕ является биологически активной добавкой, которую используют для лечения симптомов остеопороза а также в качестве дополнительного источника кальция, витамина В₆. Препарат является симбиотической композицией, которая  способствует укреплению костной ткани.

Исследуемый препарат предназначен для перорального применения взрослым по 2 таблетки массой 500мг 2 раза в день во время еды. Продолжительность приема – 1 месяц. Таким образом, суточная доза препарата для человека составляет 2.0 г или 28.6 мг/кг массы тела. С учетом коэффициента межвидового переноса доз (≈7) эквитерапевтическая доза, которая будет вводиться внутрижелудочно крысам, составит 200 мг/кг массы тела. Также в эксперименте оценивалась доза, в десять раз превышающая эквитерапевтическую – 2000 мг/кг, так как введение максимальных доз предполагает выявление возможных токсических эффектов или гибели части животных.

Препарат ОСТЕОМЕД ФОРТЕ вводили опытным животным ежедневно на протяжении 1 месяца, что соответствует предполагаемой длительности его применения в клинике. Препарат ОСТЕОМЕД ФОРТЕ животным вводили один раз в день шприцом с желудочным зондом. Контрольным животным при тех же условиях вводили стерильную воду. Общие условия распределения животных по группам и дозирования препарата ОСТЕОМЕД ФОРТЕ приведены в таблице 2.

Табл. 2 Расчет доз для перорального введения препарата ОСТЕОМЕД ФОРТЕ.

7. Распределение по группам и идентификация животных

Животные были распределены по группам рандомизированно, с использованием в качестве основного критерия массы тела, так, чтобы различия в массе тела между особями одного пола не превышали 20%.

6. Идентификация животных.

Каждому животному присваивали индивидуальный номер, нанесенный несмываемым маркером у основания хвоста.

7. Прижизненные манипуляции с животными.

Учет гибели и клинический осмотр животных проводился ежедневно в течение всего курса введения исследуемого препарата.

8. Статистический анализ данных

Для всех количественных данных применяли методы описательной статистики: подсчет средних значений и стандартное отклонение, которые представлены в итоговых таблицах. Для определения достоверности межгрупповых различий данные анализировали параметрическими или непараметрическими критериями в зависимости от типа распределения количественных данных. Различия определяли при уровне доверительной вероятности 95%.

3. Результаты

3.1 Результаты клинического наблюдения

Изучение подострой токсичности лекарственного средства ОСТЕОМЕД ФОРТЕ проводили на крысах Вистар (самках и самцах, массой тела 185 – 195 г). Исследуемый препарат вводили внутрижелудочно крысам в объеме 3 мл, контрольным животным вводили стерильную воду в том же объёме на протяжении 30 дней один раз в день шприцом с желудочным зондом.

Установлено, что под действием испытываемого препарата, вводимого крысам в течение 30 дней в дозах 2000 и 200 мг/кг, общее состояние животных было удовлетворительное и не отличалось от контрольной группы. Различий в потреблении воды и корма, а также в поведенческих реакциях крыс в опытной и контрольной группах не обнаружено.

3.2.Результаты гематологического, биохимического и коагулологического анализа крови.

Гематологические, биохимические, коагулологические показатели крови крыс линии Вистар представлены в таблицах 3-5.

Табл.3. Гематологические показатели крови крыс линии Вистар, получавших препарат ОСТЕОМЕД ФОРТЕ в дозе 2000 и 200 мг/кг.

Табл.4. Биохимические показатели крови крыс линии Вистар, получавших препарат ОСТЕОМЕД ФОРТЕ

Табл.5. Коагулологические  показатели крови крыс линии Вистар, получавших препарат ОСТЕОМЕД ФОРТЕ.

Как следует из представленных данных, препарат ОСТЕОМЕД ФОРТЕ при многократном пероральном введении крысам Вистар в течение 30 дней не вызвал сколько-нибудь значимых изменений исследованных гематологических, биохимических и коагулологическихпоказателей крови подопытных животных в сравнении с контрольными.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенного экспериментального исследования подострой токсичности препарата ОСТЕОМЕД ФОРТЕ при пероральном введении крысам Вистар в течение 30 дней в дозах до 2000 мг/кг установлено отсутствие токсического влияния указанного препарата на организм подопытных животных на основании данных клинического наблюдения, а также результатов изучения гематологических, биохимических и коагулологических показателей крови.

Список литературы:

1.Т.А. Гуськова. Токсикология лекарственных средств. Москва, Изд. Русский врач, 2003, 154 с.

2.СП 2.2.1.3218-14 «Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)» от 29.08.2014г.

3.Коржевский Д.Э., Гиляров А.В. Основы гистологической техники. СПб, СпецЛит, 2010, 95с.

4.Хабриев Р.У. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ.  Москва, 2005 с.40-46

5.Миронов А.Н. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств . Гриф и К, 2012.

Приложение 1

Показатели исследования крови у крыс

Гематологические показатели

1

2

3

4

5

6

Биохимические показатели

7

8

9

10

11

Коагулологические показатели

12

13

14

15

16

17